01 流式细胞术的概述：流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。 02流式细胞术的简史1934年A.莫尔达万首次报道了使悬浮的红细胞通过放置在显微镜载物台上的玻璃毛细管的细胞自动计数方法。1956年W.H.库尔特介绍一种利用细胞在导电溶液中,通过两个小室间小孔（75～100微米）时的电阻变化（称为库尔特电阻）进行细胞计数和测定细胞体积的装置。1965年L.A.卡门茨基制成了多参数流式细胞计，可测定细胞大小和核酸含量。同年，M.J.富尔怀勒又制成细胞分选器。1969年范迪拉等应用氩离子激光器和分层壳流技术，建立了一台液流、照明光轴和检测器轴互相正交的流式细胞计。
以后，经H.R.休利特等改进了的细胞分选计，能使流动液体内的细胞喷射到空气中进行测量。但上述各系统中，所使用的激光光束以及设在收集荧光的检测方向上的限制光栏都比液流中的细胞大，因而不能提供关于细胞形态学方面的信息，故称为零分辨率系统。随后，L.L.惠利斯和S.F.帕滕发展了一种低分辨率的狭缝扫描技术，可以测定细胞核荧光、细胞和细胞核的大小。1969年，W.格德和W.迪特里希描述了使用汞灯做光源的流式细胞光度计，在落射光照明下，可激发在流动室中与光轴平行流动的细胞。
03流式细胞术的原理待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管，用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测定的结果用单参数直方图、双参数散点图、三维立体图和轮廓（等高）图来表示。

对细胞进行分选的原理是，由超声振荡器产生高频振荡，使流动室发生振动，把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴，有的液滴含有细胞。

这些细胞在形成液滴前，光学系统已测定了它们的信号（代表细胞的性质），如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合，或者说，如果发现了要进行分选的细胞时则在这个选定细胞刚形成液滴时，仪器给整个液流充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后，其中被选定细胞的液滴就带有电荷，而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生向阴极或向阳极的偏转，从而达到了分类收集细胞的目的。

04流式细胞术的特点

1. 检测速度快；

2. 准确性好；

3. 精确度高；

4. 细胞不被破坏；

5. 灵敏度高；

6. 可进行多参数检测；

7. 不单限于表面抗原，可根据发光度或荧光散射度来分离细胞

05流式细胞术的三大要素

1. 流式细胞仪：现在市面上有多种型号的流式细胞仪，但其基本结构都是相同的，分析性流式细胞仪有液流系统、光路系统、监测分析系统。

（1）液流系统

（2）光路系统：光路系统始于激光器，其分类分法很多，最常用的分类方法是根据其发射的激光的波长来分，如常见的有488nm的蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器，不同的激光器发出的激光照射到细胞后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。
流式细胞仪采集的光信号包括散射光信号和荧光信号，散射光信号也就是我们常说的FSC（前向散射光，反应细胞的大小）、SSC（侧向散射光，反应细胞的复杂程度）；荧光信号是细胞上结合有荧光素，被激光激发以后，会发射荧光信号。

（3）检测分析系统：流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最后得出样品群体中细胞的物理化学特征。

通道，我们可以理解为就是光电倍增管，有2个作用，①将光信号转变为电子信号；②放大电子信号。可以分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）和荧光通道，一个激光器下可以有多个荧光通道，一个通道对应多个荧光染料

2、样品细胞：流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，必须先将组织制备成单细胞悬液。

3.荧光偶联抗体：样品细胞只有标记荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号，从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱等情况。

06流式细胞术的基本操作与技巧

1）细胞的制备、培养
2）封闭
3）荧光素偶联抗体标记
4）光电倍增管电压的设定
5）对照的设置
6）补偿调节

以体外培养的PBMC细胞为例：
 

1、细胞培养在96孔板中，直接收集细胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C离心5min，弃上清；

2、然后用1ml FACS buffer重悬沉淀，350g，4°C离心5min，弃上清；

3、封闭：标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体，其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。但是，有些细胞表面表达FcR(Fc receptor, Fc受体），如巨噬细胞、DC、B淋巴细胞等， FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对结果产生一定的影响。

封闭方法1：取适量的血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。原则是，如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。

封闭方法2：适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。CD16是一种FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力较强；CD32也是一种 FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力中等。而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用抗CD16和抗CD32单克隆抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32单克隆抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。

4、标记相应的荧光素偶联抗体，这里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色体系推荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假如有9个样本，分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，350g，4°C离心5min，弃上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀，尽快上机分析。

6、电压的设定：上机分析时，确认机器没有问题后，首先就是调节每个通道的光电倍增管的电压，目的是为了区分细胞群，假如我们想研究人的淋巴细胞群，我们都知道人的PBMC含有淋巴细胞、单核细胞还有中性粒细胞等，那我们怎么把它们分开呢？这时候就要用到我们前面提过的FSC和SSC，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，原则就是使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后就开始调节APC-cy7、FITC的电压（我们可以在铺细胞的时候多铺一个孔，染色时将CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC电压的调节），原则就是使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。