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上海联迈生物工程有限公司(LMAI Bio) 是一家经营生物、仪器、试剂、耗材等科研产品的高新技术生命科学公司,在广大用户的帮助和支持下,经过不懈的努力, 已成为国内生命科学领域产品的一家供应商,代理许多国际先进水平的高科技产品,包括分子生物学、细胞生物学、免疫学、诊 断等多个研究及应用领域。 公司的服务和业务网络遍及全国,在同行获得一致好评。 特别是生物试剂和细胞产品更是种类齐全、价格实惠,美国原装进口原代细胞,专业培养基,常用传统培养基,细胞培养用的相关试剂,氨基酸,抗生素,维他命类产品品种齐全,试剂耗材种类繁多。 公司的规模和产品种类日益扩大和更新,我们一直秉承着代理优质品牌的产品,服务好每一位顾客,将好的科学技术和方法推荐顾客的服务宗旨为广大客户提供各类服务,产品、技术咨询、国际国内信息。联迈生物(LMAI Bio) 以「为生命科学发展贡献力量」为己任,已与多家国际知名厂商达成了长期合作协议,主要包括 Affymetrix(eBioscience)、PeproTech、Prospecbio、QIAGEN、Genwaybio、Quidel、Bio-Techne(RnD、Novus)、Roche、abcam、CST、BD 、SIGMA,Bioporto 等。联迈生物 (LMAI Bio) 时刻跟踪新科技,密切关注国内外科研动态和新兴公司的发展,力争为中国用户引进更多、更好、更新的技术和产品。联迈生物(LMAI Bio) 不仅为客户提供「高质量的产品」,同时也提供「优质的服务」,公司拥有一批基础知识扎实、产品知识丰富的销售人员,以及在生命科学领域经验丰富并且十分专业的技术支持团队,随时为客户提供技术咨询和售后服务。 主营产品/服务: 试剂盒:ELISA 试剂盒、免疫组化试剂盒、分子生物学试剂盒、细胞凋亡试剂盒。 
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细胞铺板的这些手法,你都知道吗?

人阅读 发布时间:2021-11-29 15:18

细胞铺板是细胞实验中最常见又必须掌握的一门技术,看起来是非常简单的一项操作,但其实却经常会遇到:细胞分布不均匀的情况。要知道把用于实验的细胞铺的均匀且密度适宜,不仅看起来赏心悦目,更是决定了我们实验的稳定性。但是后来才发现,其实细胞铺板是有规律可循的,今天我们就来了解一下:细胞铺板的技巧。我们先来看两组细胞分布不均的图片。

图一:中间多

图片

图二:周围多

 

为什么要细胞铺板 

需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率(IC50)测试时,通常使用96孔板,一方面可以设置浓度梯度;另外还可一次性测多个药物,减少实验误差。下面我列举一些常见的几种培养皿规格,大家可根据自己需求自行选择:

图片

作为一个资深吃货,我用一个通俗易懂的例子,来跟大家解释不知道大家有没有发现,其实细胞铺板和摊煎饼有一点点相似呢?

 

煎饼的制作:准备好锅、食材等,把平底锅锅洗干净,平底锅内擦一层油,盛一勺面糊倒入锅内,旋转锅面使面糊均匀流动糊满锅面,然后点火用最最小火煎半分钟,关火收工。

 

铺细胞也是一样一样的:

首先需要一个液化气罐(酒精灯),一个平底锅,根据实验需求(有6孔板、12孔、24孔、96孔),你还需要有一瓶豆油(培养基),刷锅水(PBS),勺子(移液器),各种调料(mimics、inhibitor、G418、5-FU、lipo2000等),面糊(细胞悬液)。

 

好了,下面可以开始做煎饼了(铺细胞):

1、点火;

2、准备好工具和调料;

3、刷锅水(PBS)洗两遍;

4、放点油(培养基),摇匀;

5、倒入拌匀的面糊(细胞悬液)﹔

6、摇匀,这一步骤很关键,摇不匀,煎饼就不好看了,前后摇晃10次,左右10 次,逆时针一次,顺时针一次;

7、放点调料,好了。关火,放到保温箱里,等你饿了(转染),随时就可以享用了。

细胞铺板收的三种手法: 

1、细胞板子先加入一定量(一般是总量培养基的1/5)的培养基,放入孵箱中放置10-20min;

2、在滴入细胞时,细胞板子与通风橱有一定的角度,沿着板壁的孔边缘滴入;

3、滴入后,呈“8”字方法摇晃5-8次;

4、置于水平台上,放置10-20分钟;

5、放入孵箱

其实细胞铺板不一定都需要单个单个的那么均匀,比如做免疫荧光时,因为这个样子可以同时检测到单个细胞的形态,另外又可以照一点低倍的用作于统计,所有的细胞都在一个环境中。特别说明一下:这里的多也只是相对于多,细胞也是单层的。

铺细胞时要注意手法如下:

1、细胞板子不需要提前用培养基润洗,直接从边上滴入混有细胞的培养基;

2、放置30s-1min后,前后摇晃5-8次;

3、放在水平台上静置2-5min;

4、放入孵箱。

一般在提取蛋白或者提取RNA的时候有时会这样铺板,因为有些细胞刮刀不好用,没有办法刮到周围的,想要铺中间多,周围少的板子,手法如下:

1、细胞板子不需要提前润洗,从中间滴入进去后;

2、把板子朝一个方向顺时针或者逆时针旋转3-5圈;

3、水平台上静置2-5min;

4、放入孵箱。

 

细胞铺板收的常见问题解答 

1、细胞计数前后出现较大误差?

  • 考虑细胞沉降导致悬液不匀;悬液体积过大或过小;稀释倍数太高或太低等原因造成。

2、如何克服细胞悬液不均匀的问题?

  • 尽量将细胞吹打为单个,防止抱团,且用移液枪充分吹打,使其均匀悬浮在培养基中。

3、一般加多少细胞悬液合适?

  • 由于加入计数室的量,过少会导致计数室内出现气泡,过多则会使得计数板上的盖玻片不紧贴计数板,使得高度变高,体积变大;计数室体积为9mm3,所以一般加15ul左右。

4、计数时,细胞稀释倍数如何控制?

  • 若是计数室细胞过稀或过密,会造成较大误差,一般最适浓度为5~10×105细胞/ml。如一般10cm皿的细胞约300-500万个,一些细胞个体小也能达到1000-2000万,可根据所需细胞数目取出部分作稀释或连续稀释后计数。举例来说可将100ul细胞悬液加入到900ul培养基中,混匀后进行计数,计数所得乘以10即为实际细胞密度。

5、计数的原则有哪些?

  • 计数时对压在最外圈边线的细胞遵循“计上不计下,计左不计右”的统计学原则,遇到两个以上的细胞组成的细胞团计为一个细胞

6、对于某些容易聚团的细胞,该怎么办?

  • 对于容易聚团的细胞,尽管当时摇匀了,但是静置30min后,取出后将细胞培养板后,肉眼即可见严重的细胞居中抱团现象,比如乳腺癌细胞MDA-MB-231。对于这种细胞解决办法:从个人经验来看,若是时间允许的话,可以降低接种密度,可以隔一天细胞多了再进行药物处理或者划线等。

7、 如何避免每个孔之间的细胞不均匀?

  • 铺板速度尽量快点,在加完半边板后,需要再次将培养皿内剩余的细胞悬液充分混匀再继续铺板。

 

细胞铺板是一个经验积累的过程,手法也需要积极的改进,不要生搬硬套,也不要一味追求绝对的铺均匀。我们在实验过程中多思考细胞本身的特征和属性,在做实验的过程中,不断尝试、不断失败、不断积累,从中得出自己的结论,希望大家可以把在实验过程中出现的问题都能积极解决。

 

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