我们常说，细胞生物实验入门，过了养细胞的关卡，接下来就是MTT了。所以，MTT是什么？MTT是一种黄颜色的粉末状化学试剂，中文名噻唑蓝。其主要作用为检测细胞存活与生长。

 

MTT主要两个用途 

1、药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;

 

2、细胞增殖及细胞活性测定。

MTT的检测原理 

细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶溶解所致的吸光度值与细胞数量成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞数量越多或活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。经验心得，MTT实验最终吸光度应当落于0.8~1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。

 

MTT实验所需材料 

1、MTT溶液

2、DMSO（二甲基亚砜）

3、常规细胞培养全套、实验干预相关药品、无菌离心管、无菌枪头、96孔板等

 

MTT溶液的配置：

MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。可以称取MTT0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22um滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

普通MTT实验步骤 

1：接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞（细胞浓度的问题见后面的注意事项）接种到96孔板，每孔体积100ul.

2: 培养细胞：同一般培养条件，培养1-3天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色：培养1-3天后，5×的MTT试剂盒，将其稀释至1×MTT溶液后，96孔板每孔加50ul，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线  。

药物MTT实验步骤 

（1）贴壁细胞：

1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。 

2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺于孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 

3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 

4: 每孔加入50ulMTT溶液，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 

5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。 

6: 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 

7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。 

（2）悬浮细胞： 

1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），

按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；

②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试验寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；

③需检测物10ul；

④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640） 

2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 

4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 

5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。  

MTT结果分析 

关于如何计算IC50

 

1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

 

Xm:lg 最大剂量

 

I:lg(最大剂量/相临剂量)

 

P:阳性反应率之和

 

Pm:最大阳性反应率

 

Pn:最小阳性反应率

 

举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下

 

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

 

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：

 

代入计算公式：

 

Pm=0.869

 

Pn=0.135

 

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

 

Xm=lg100=2

 

lgI=lg100/50=0.301

 

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

 

IC50=45.186

 

该药物的IC50值为45.186ug/ml

MTT注意事项 

1. 选择适当得细胞接种浓度。

2. 避免血清干扰。一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3. 设空白对照。与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

4. MTT实验吸光度最后要在o-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。

5. 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和 DMSO合适根据书上说的加200 uL 1640培养基,20 uL MTT,150uL DMSO加 DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲攒颗粒进行比色测定。

6. 一般每孔400o个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/mL，MTT加20uL，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓒洗掉，然后每孔加150 uLDMSo，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。