【技术分享】细胞侵袭必备技能-Transwell 实验

Transwell原理示意图

b）基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了；

c）上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05%-0.2%BSA；

d）下层培养液：下层培养液采用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞转移力而定，转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子“引诱”细胞转移，如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子；

e）细胞培养板：常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中，以24孔板最常用，下面就以24孔板为例。

用 Matrigel 1：8 稀释（可以直接用无血清的培养基稀释），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝胶

2.接种细胞

用无血清培养液配成单个细胞悬液，以每孔合适的细胞数量接种到transwell小室内。

3.固定封片及染色

取出transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗涤2遍，甲醇固定30min，将小室适当风干；0.1%结晶紫染色15分钟，PBS冲洗干净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞；

4.结果统计

400倍显微镜下随机选取5个视野统计结果。

说到结果统计分析，一般来说，对Transwell侵袭实验结果统计分析有两种方法

通过给细胞染色，直接在镜下计数。选择不同的视野拍照（一般选择呈现视野中穿过的细胞），计数的结果可做成统计图，辅助呈现数据

间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。它包括：MTT法、 荧光试剂检测、 结晶紫检测。

那这两种方法，我们应该怎样选择？

实际上，我们一般选择直接计数法，但是在遇到细胞数量过多，难以计数时，我们可以选择第二种方法。

不同的细胞，其侵袭能力是不同的，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，最后会难以统计结果；而细胞量过少，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，进入下室。因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，将小室放入培养板时要注意，如有气泡产生，须将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

培养时间主要依癌细胞侵袭能力而定，时间点的选择除了要考虑到细胞、细胞侵袭力及处理因素等。

注意铺胶厚度，太薄不能盖过底，太厚将加长其接触底面时间，在实验预定时间内不能收到预期结果。

对于比较难穿膜的细胞，可以在实验开展前撤掉血清节饥饿处理12h-24h。