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细胞培养的概念

细胞培养技术又称细胞克隆技术，是指将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境中（无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件），使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养技术在生物、医学研究等领域都有着广泛的应用。

     

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 体外培养细胞的分型

  

什么是原代培养

机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

  

什么是传代培养

将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。

贴附型细胞主要分为以下几个类型：成纤维细胞型；上皮型细胞；游走细胞型；多型细胞型。悬浮型的则见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞等。

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细胞培养的条件

在细胞培养的过程中，我们应该要根据不同的细胞的自身特点，去给他们提供不同的满足其生长和发育的一些基本生理条件：

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合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的zui重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。

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目前,大多数合成培养基都需要添加血清.血清是细胞培养液中zui重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。

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无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡.因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物。

 

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气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。

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细胞培养的一般过程

 

准备工作

准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。

 

取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

 

培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

    正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH 是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2 浓度也要定时检查。

    一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

 

冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。流程图如下：

    复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。流程图如下：

 

    冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。