【蛋白纯化方法】凝胶过滤层析实验

材料与仪器

• 蛋白质溶液
• 缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙晴、乙酸、胃蛋白酶
• 低压层析系统

1. 凝胶的填装

1.1 凝胶的溶胀

如果凝胶是脱水的干粉（例如 Sephadex）在使用前需要溶胀。

• 一份凝胶加 10 份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。
• 在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。
• 自然溶胀需要 24 h 至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常 1～2 h 即可完成。这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。
• 无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气 1 h。

1.2 装柱

• 将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。通常放在专用的层析冷柜中；
• 装柱前取 3/4 体积的凝胶和 1/4 体积的缓冲液制成凝胶浆；
• 对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；
• 将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。这样可以排除层析柱中支撑滤片以下空隙中的气泡；
• 沿柱子一侧或沿一根玻璃棒倾入凝胶浆，必须一次完成，否则柱床不均一；尤其要注意在装柱过程中不要产生气泡，如果在装柱早期出现气泡，可用一玻璃棒搅动，使气泡排出；
• 当凝胶装到柱底之后，打开柱底出口以加快装柱进程，随之加入更多的缓冲液；
• 将层析柱与蠕动泵和贮液器相连接，用几倍柱床体积的缓冲液洗涤层析柱，以使其稳定和平衡；
• SephacrylHR 和 Superose 凝胶以不同的流速分两步装柱（详见使用说明书）；
• 注意任何时候都不得使层析柱缓冲液流干，这样就不能进行正常层析分离了。

1.3 层析床的检查

因为气泡和层析柱的不均一性会明显降低层析分辨，所以在层析前必须仔细地检查层析床的均匀性。

• 用眼对光观察层析柱有无气泡和裂纹。
• 用 2 mg/ml 蓝色葡聚糖溶液进一步精确检查层析床的均匀性。用量为柱床体积的 1％， 两倍用量的洗脱液即可将蓝色洗脱下来。常用洗脱液为 0.02mol/L 氯化钠。如果连接实验时，必须避免盐的存在，则可再用水洗脱。若微量的蓝色葡聚糖吸附于凝胶表面时，常用血清白蛋白溶液洗脱。

蓝色葡聚糖的蓝色是显而易见的，如果柱子装的好，可见到蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，而不留任何条纹。

如果是 Bio-Gel P 柱，也可用血红蛋白和铁蛋白代替蓝色葡聚糖作为检查用的标准参照物。因为它们也是有色蛋白。蓝色葡聚糖也可用于测量层析柱的外水体积。外水体积是指不能进入凝胶中的任何微孔的大颗粒物质从柱上洗脱下来的所需的洗脱液体积，外水体积是蛋白质可能从柱上被洗脱下来的最小必需体积，它可以作为预测其他蛋白质所需洗脱液用量的相对标准。

2. 样品上柱及洗脱

2.1 样品上柱

• 蛋白质样品应该高度浓缩（10～20 mg/ml）， 体积应尽量小（适当的上样量为柱床体积的 1％～5％），上样量高于柱床体积的 5％，则将降低分离效果。而低的柱床体积并不提高分离效果，此外样品黏度不能太高，否则会使层析区带不稳定和流速无规律，导致区带变宽或歪曲。
• 上样前，样品须经孔径内 0.2 um 的滤膜过滤或在 10 000×g 离心 5 min，以除去干扰层析的残渣。
• 选择的缓冲液应该有利于蛋白质活性的保持并可防止非特异的蛋白质之间或蛋白质与凝胶之间的相互作用。一般低离子强度的盐溶液（20～100 mmol/L）， 足以阻断非特异的离子间相互作用。在某些情况下，蛋白质与凝胶之间会产生疏水性相互作用，这时不应该用高离子强度的盐溶液。

层析柱经平衡后，待平衡液流至床表面以下 1～2 mm 时，关闭出口。不允许流干, 柱干后必须重装；

用加样器将样品加至柱床表面以上 2～3 cm 时，接上恒压样品瓶，并打开出口，使样品渗胶内。样品加完后，用小体积的洗脱液洗表面 1～2 次，尽可能少稀释样品。当样品接近流干时，像加样品那样仔细地加入洗脱液，至床表面以上 2～5 cm 时，即可接上恒压洗脱瓶开始层析。以上所有操作步骤都须时刻注意层析表面的均匀性。

2.2 样品洗脱

• 缓冲液流经层析柱进行洗脱直至目的蛋白被检出为止；
• 通常用蠕动泵控制层析柱的流速。使用泵的压力不要超过凝胶的耐受程度；
• 由于凝胶过滤层析经常需要进行数小时以上，为了避免层析柱流干，在不使用蠕动泵时，可在贮液瓶与层析柱上端入口入加一根软管其长度与柱的出口处持平，使缓冲液先流经软管再到达柱内。
• 理想的样品回收率可高达 85％ 以上；
• 低流速可提高峰的分辨力；
• 关于蛋白质分子量测定（主要是非变性条件下的球蛋白）可以通过对蛋白质标准品的凝胶过滤柱层析来解决。但此法不能用于变性条件下的分子量测定。用标准蛋白的冼脱体积对其分子量的对数作图得到一条标准曲线。用未知蛋白的洗脱体积到标准曲线上可査出相应的分子量。

3. 层析柱的再生与保存

由于凝胶不可能与蛋白质结合，因此从凝胶上除去蛋白质不是一件难事。通常用稀的氢氧hua钠或非离子型去垢剂清洗可除去大部分的结合物质。然而避免层析柱污染的最有效方法是进样前将样品过滤以及用新过滤的缓冲液进行层析。如果经过以上标准程序洗涤，某些污染物仍不能清除时，可从柱中倒出树脂，按下述方法进行特殊处理后，再重新装柱。用 24％ 乙醇或 30％ 乙腈对层析柱洗脱过夜可除去疏水蛋白；用 30％～50％ 乙酸洗脱或用 1 mg/ml 胃蛋白酶（溶于 0.5mol/L NaCl 和 0.1 mol/L 乙酸）将层析柱内凝胶孵育过夜可去除亲水蛋白。用蛋白水解酶处理可分解凝胶中剩余的衡量胃蛋白酶。用 TE 缓冲液，（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH 8.2）洗涤或用核酸酶处理可去除核酸。层析柱用非离子型去垢剂如：0.2％～1％　NP-40 或 Lubrol 洗脱过夜可洗去脂类物质。

层析柱须保存于含防腐剂的缓冲液中并放置在低温环境下，这样有助于防止微生物滋生。通常在缓冲液中加入 0.02％ 叠氮钠可防止微生物生长。Sephacryl HR 或 Sepharose CL 可用 20％ 乙醇保存。有些凝胶可采用高压灭菌防止微生物生长。

注意事项 

1. 加样时不能用一般滴管，要用下口较大的滴管，以免滴管头所产生的压力搅混柱床表面。

2. 加样操作要热练而仔细，避免搅混往床表面。在平衡时柱床表面常常会出现凹陷现象，因此必须检查柱床表面足否均匀，如果不符合要求，可用细玻璃棒轻轻拨动表面层，让凝胶自然沉降，便表面均匀。

加样品的方法是利用两种液体比重不同的分层的原理，将高比重样品加入床表面低比重的洗脱液之中，样品就缓慢均匀地下沉于柱床表面。再打开出口，使样品渗入层析床。如果样品比重不够大时，可在样品中加入葡萄糖或洗精使其终浓度达 1％。

常见问题解析

1.出峰对称性差

出峰上升时，上升缓慢是填料装填过紧，而拖尾是因为装填的太松，此时对称因子及柱效都很差，出现这种情况就要重现装柱。装柱前要了解填料的压缩系数（压缩因子）如Seplife FF系列的填料的压缩系数是1.15，且装完后要测柱效。

2.柱床出现干涸或裂缝等塌柱现象

检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡，必要时重新装柱。

3.分离度差

待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量小于2倍且都在选择的填料的排阻极限之外或者之内。若样品中目标物质的分子量和其它杂质的分子量小于2倍时，建议尝试其它方法分离，反之选择凝胶过滤层析时，填料的选择应根据样品中目标分子的大小选择最接近（大或小都可以）目标分子排阻极限的填料进行分离。

通过测柱效等方式确保柱床装填的满足凝胶过滤层析的过程。

根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量，如脱盐等样品中目标分子和杂质的分子量大于50倍时，上样量可以达到柱床体积的25%，最高不超过30%，若样品中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时，通常上样量控制在柱床体积的5%以内。

凝胶过滤的过程流速不宜过快，降低流速在一定程度上可以提高分离度。

随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。

样品粘度过大也会导致分离度下降，粘度大的样品在凝胶过滤时要对其进行稀释处理再凝胶过滤；

样品中目标物质和其它杂质的非特异性结合或者作用力，此时就要尝试添加一些添加剂（如2%的Triton x-100,150mM NaCl等），减少样品中各组份之间的作用力；

样品的pH，离子强度对某些填料的柱床体积会产生一些影响，也会影响分离度，必要时可以优化样品的缓冲液。

4.反压大，流速慢