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上海联迈生物工程有限公司
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Elisa实验常见问题及解决方案
人阅读 发布时间：2017-12-22 15:48
Elisa实验常见问题及解决方案
| 问题 | 序号 | 可能原因 | 解决方法 |
| 显色淡，灵敏度偏低 | 1 | 试剂盒未充分平衡 | 试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃） |
| 2 | 样品不适合做ELISA检测 | 样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分） | |
| 3 | 酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 | 防止板过于干燥 | |
| 4 | 包被抗体遭到破坏 | 操作温和，移液枪不能碰到孔底 | |
| 5 | 样本和抗体孵育条件不合适 | 按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。 | |
| 6 | 洗涤浸泡时间过长 | 按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间； | |
| 7 | 偶联HRP试剂污染 | 弃去试剂，重新配置 | |
| 8 | 错误的稀释偶联HRP试剂 | 弃去试剂，重新配置 | |
| 9 | TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间 | 确定合适的孵育时间：人为判定-最高浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65 | |
| 10 | 样本浓度过高或存在基质效应 | 建议做不同稀释倍数，确认样本最佳稀释倍数。 | |
| 11 | 酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对 | 确认仪器设置及选择正确的波长检测。 | |
| 12 | 酶标板不适合做ELISA | 不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。 | |
| 背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2） | 1 | 洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 | 洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。 |
| 2 | 底物污染，未避光保存，出现颜色 | 弃去底物，重新配置 | |
| 3 | 样品稀释液污染 | 弃去稀释液，重新配置 | |
| 4 | 吸头重复使用，未洗净或消毒不彻底 | 吸头尽可能一次性使用 | |
| 5 | 不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间） | 最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。完全按照说明书要求。 | |
| 6 | 偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高 | 按照说明书调整到最佳的浓度 | |
| 7 | ELISA板子不正确的贮存 | 酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的Elisa板 | |
| 8 | 没有正确封闭 | 在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间 | |
| 9 | 样本溶血严重 | 建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。 | |
| 重复性不佳，高CV值 | 1 | 样品不均一 | 加样前充分混匀样品，取样确保移液位置一致； |
| 2 | 包被板表面遭到破坏 | 洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面 | |
| 3 | 孔与孔之间的交叉污染 | 孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用 | |
| 4 | 加样量不一致 | 样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 | |
| 5 | 边缘效应（外周孔显色较中心孔深） | 孵育时尽量100 rpm旋转混匀 | |
| 6 | 微量加样不准确 | 保证微量加样的准确性和均一性 | |
| 7 | 不正确的洗涤 | 洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，确定每一步的洗涤 | |
| 出现白板，阳性对照不显色 | 1 | 显色液变质 | 更换新的显色液 |
| 2 | 洗涤液配制有误 | 请按说明书所示稀释倍数配制 | |
| 3 | 未加酶结合物而认为已加入 | 注意不要漏加 | |
| 4 | 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 | 每次加液前均应看清标签 | |
| 5 | 标准品稀释方法错误/或标准品有问题 | 请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数 | |
| 6 | 不同试剂盒或不同批号的试剂混用 | 建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。 | |
| 不正常的标准曲线 | 1 | 错误的方法重悬标准品 | 加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分 |
| 2 | 标准品稀释错误 | 按照说明书要求稀释标准品 | |
| 3 | 标准品污染 | 使用一次性的灭菌吸头， 标准品贮存于2-8 ℃ | |
| 4 | 错误的倍比稀释步骤 | 按照说明书倍比稀释标准品 | |
| 5 | 波长选择错误 | TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而 前者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。 | |
| 6 | 标准品混用 | 不同批号试剂勿混用 | |
| 7 | 试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活 | 尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温 | |
| 8 | ELISA未终止而直接检测450nm和620nm | TMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。（数值仍有梯度规律） | |
| 样品或标准品OD超出正常范围 | 1 | 错误的样品或标准品的稀释 | 完全按照说明书稀释 |
| 2 | 偶联抗体浓度过高 | 按照说明书调整到最佳的浓度 | |
| 3 | TMB底物孵育时间过长 | 调整到合适的孵育时间 | |
| 4 | 样品或标准品污染 | 避免污染 | |
| 5 | 错误的孵育时间或温度 | 完全按照说明书 | |
| 6 | 孵育时未加盖导致溶液挥发和污染 | 贴封片或加盖 | |
| 标曲很好，但是样本无法计算到数值 | 1 | 标曲选择不合适 | 选择最合适的标曲拟合； |
| 2 | 样本含量很低，低于灵敏度无法被检测到 | 尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测 | |
| 3 | 样本含量很高，超过标曲 | 建议进行预实验摸索稀释倍数，确保样本OD值落在标曲范围内 | |
| 标曲高浓度间无明显趋势 | 1 | 如OD绝对值靠谱，但是仅无梯度，则显色过度 | TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。 |
| 2 | 仅作单波长检测。 | 由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。 |
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