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技术资料/正文
慢病毒载体以 HIV-1 发展起的基因治疗载体
1118 人阅读发布时间：2020-01-10 09:41
产品简介：
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为 siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
简要步骤：
1、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
（1）慢病毒转染前 18-24 h，将贴壁细胞以 1×105 个/ml 铺到 6 孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为 2×105 个/ml 左右。
（2）次日，用含有 6 μg/ml polybrene 的 1 ml 新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃ 孵育。
（3）（对 polybrene 毒性敏感的细胞选作此步骤）8 h-16 h 后，观察转染情况，更换新鲜培养基 1 ml/孔，37℃ 培养。
（4）如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染 48 小时后可见明显荧光表达，72 小时后更加明显。如需 FACS 检测转染效率，可在转染后 72-96 小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染 3-4 天后开始加药。
2、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
（1）在 2×105 个/ml 悬浮细胞中加入 polybrene 至 6 μg/ml 和适量病毒，充分混匀。37℃ 孵育。 如果该细胞株不易受慢病毒感染，可以使用离心孵化的方法。即在细胞培养板上加入病毒感染液后在离心机上以 2500rpm(1000-1500 g) 在 32℃ 或者室温下离心 90 min。
（2）（对 polybrene 毒性敏感的细胞选作此步骤）8 h-16 h 后，观察转染情况，更换新鲜培养基 1 ml/孔（6 孔板），37℃ 培养。
（3）继续培养 1-3 天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为 siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
简要步骤：
1、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
（1）慢病毒转染前 18-24 h，将贴壁细胞以 1×105 个/ml 铺到 6 孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为 2×105 个/ml 左右。
（2）次日，用含有 6 μg/ml polybrene 的 1 ml 新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃ 孵育。
（3）（对 polybrene 毒性敏感的细胞选作此步骤）8 h-16 h 后，观察转染情况，更换新鲜培养基 1 ml/孔，37℃ 培养。
（4）如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染 48 小时后可见明显荧光表达，72 小时后更加明显。如需 FACS 检测转染效率，可在转染后 72-96 小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染 3-4 天后开始加药。
2、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
（1）在 2×105 个/ml 悬浮细胞中加入 polybrene 至 6 μg/ml 和适量病毒，充分混匀。37℃ 孵育。 如果该细胞株不易受慢病毒感染，可以使用离心孵化的方法。即在细胞培养板上加入病毒感染液后在离心机上以 2500rpm(1000-1500 g) 在 32℃ 或者室温下离心 90 min。
（2）（对 polybrene 毒性敏感的细胞选作此步骤）8 h-16 h 后，观察转染情况，更换新鲜培养基 1 ml/孔（6 孔板），37℃ 培养。
（3）继续培养 1-3 天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
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